选择性剪接和dna甲基化相互关系地研究 - 蚂蚁淘网

来自 : 发布时间：2025-04-04

公司旨在为客户提供高质量的实验外包服务（CRO服务），包括实验方案设计，常规基因工程实验操作，重组蛋白表达与纯化，重组抗体制备，天然蛋白分离与纯化，病毒分离培养等免疫学相关技术服务；同时我们也为工业客户提供部分IVD级别抗体和抗原原料。核心平台：---噬菌体抗体展示技术平台苏州蚂蚁淘生物科技有限公司利用自有的噬菌体（M13，T7噬菌体）展示技术平台，能够为客户提供极具性价比的重组Vhh抗体（纳米抗体/驼类纳米抗体）制备方案，包括动物免疫，文库建立，文库筛选以及重组抗体的体外表达等。---抗体工程技术平台卡梅德生物科技的抗体工程平台包含单克隆抗体制备服务平台，多克隆抗体制备服务平台，抗体测序与改造平台。单克隆抗体制备平台：基于杂交瘤技术的小鼠单抗技术平台，最快能够在2-3个月获得高亲和力与高特异性的单克隆抗体，同时基于噬菌体展示技术，我司能够制备多物种的重组单克隆抗体，包括小鼠，兔子，骆驼，羊驼以及人单抗。多克隆抗体制备服务平台：能够为客户提供兔多抗，羊多抗，骆驼类多抗，牛多抗等多物种的抗体制备服务，根据不同的抗原类型，来自蚂蚁淘生物的资深抗体专家会为您量身定做适合您需求的方案，以满足您的项目要求并节省您的宝贵时间。抗体一级序列测序平台：为满足大量客户对抗体基因序列与氨基酸序列信息的需求，我们为客户提供De Novo抗体全长氨基酸序列解析和N端测序服务；同时我们设计积累多达80种杂交瘤抗体基因测序引物。抗体改造技术平台：蚂蚁淘生物技术的抗体改造平台包括嵌合抗体制备，抗体亲和力成熟以及抗体人源化服务。目前我们已经成功制备十几例嵌合抗体与人源化抗体，均成功交付。---蛋白表达与纯化服务技术平台蚂蚁淘生物科技目前拥有四大蛋白表达平台，能为客户提供全面且优质的蛋白表达技术服务。哺乳动物表达平台：目前公司拥有Freestyle CHO，Expi CHO，CHO-DG44，HEK293F，Vero等细胞系用于蛋白表达制备。公司秉承质量优先原则，全部统一采用Gibco细胞培养基和相关转染配套试剂，以保证每个批次的哺乳动物细胞蛋白表达产品高质量、高表达水平的交付。同时公司拥有的表达载体体系，远高于市面常用蛋白表达载体，能够为客户提供高纯度蛋白。昆虫细胞表达平台：目前公司常采用的昆虫表达细胞为SF9，配套使用的是来自Gibco的培养基，只...

shRNA比siRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染，克服了某些类型的细胞不能转染的难题，能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达，能够与报告基因共表达。此外，它们能减少脱靶效应（在下面进一步讨论）。一般方案设计siRNA和shRNA许多实验室已发表了用于转染的长双链RNA的合成方案。但是，每种方法的效力是依赖于整个系统的。此外，长双链RNA会激活先天免疫反应，导致细胞死亡。影响shRNA活性的因素，包括环结构，发夹结构热力学性质，二级结构以及周围序列。siRNA和shRNA之间进行选择时，要考虑的一个重要因素是实验时间的长短。siRNA在细胞中瞬时表达的，而shRNA可以通过病毒介导的转导保持稳定。siRNA/shRNA设计指导在主要RNAi产品制造商那里都能获得

19-29个核苷酸的siRNA序列通常是最有效的。长于30个核苷酸可导致非特异性沉默。

识别的理想位点包括靶mRNA序列中的AA二核苷酸区和3\\\'端19个核苷酸的位点。通常情况下，siRNA与3’端为dUdU或者dTdT的游离碱基的mRNA结合效率更高。较新的数据表明，其他种类的二核苷酸也可保持活性，但siRNA能够被核糖核酸酶在单链的G残基处裂解，因此应避免GG结构。

由于mRNA往往高度折叠并于调控蛋白结合的，应该要在不同位点选择至少2-4个靶序列。避免设计含有4-6个poly（T）的序列，因为它会作为RNA合成酶III的终止信号。

检查以确保您的siRNA序列与其他编码序列没有同源性。

序列中的G/C含量应该在35-55％之间。

公司/组织程序名称描述链接

Thermo Scientific	siDESIGN	方便使用的siRNA设计工具。允许选择siRNA识别的区域（5’或3’ UTR或ORF区），G/C百分比，可通过BLAST搜索序列。	链接
Naito et al.	siDirect	根据核苷酸序列识别目标，提供了序列内的位置，可供选择双链的熔解温度，脱靶序列的不匹配的最小数目。	链接
Invitrogen	BLOCK-IT RNAi Designer	在核算序列内识别siRNA, shRNA和miRNA目标。也可将siRNA序列转化为shRNA序列。	链接
InvivoGen	siRNA Wizard	可搜索一段编码序列作为siRNA序列，可根据您的siRNA序列设计加扰序列和发夹插入。	链接
IDT	shRNA设计工具	shRNA设计工具能允许您在四个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点。	链接
Gene Link	shRNA设计工具	shRNA设计工具能允许您在三个环序列中选择或者输入一段定制序列，也可以指定5’端和3‘端的酶切位点，设计GC含量和长度。	链接

表二：siRNA和shRNA设计程序。shRNA应包含正义和反义序列（每个为19-21个核苷酸的长度）由环结构分隔，以及5\\\'端AAAA的游离片段。设计环结构时，Ambion的科学家和其他人建议使用9 nt的空白间隔（TTCAAGAGA），而Invivogen在某些载体中采用了长度为7 nt的环（TCAAGAG），这可根据您的系统变化。3〜9个核苷酸长度的环序列被证明是有效的。此外，当创建shRNA盒时，正义链首先合成，然后是间隔序列，最后是反义链。 shRNA结构中5\\\'端游离应避免，因为它们可能会导致shRNA的沉默。除了手动设计siRNA或shRNA，也有一些设计程序可供使用。他们中有几个包含在表二中了。此外，多个公司提供预制的siRNA和shRNA序列（代表性例子见表三）。多数shRNA通过载体转录而来。表达最常见的是由聚合酶III U6启动子驱动，它驱动高水平的组成型表达，或由较弱的H1启动子驱动。与siRNA系统相比，shRNA的一个主要优点是，shRNA可设计为诱导性的。有商品化的四环素-开和四环素-关诱导系统，以及结构含有改良的U6启动子由昆虫蜕皮类固醇性激素蜕皮激素诱导。一个Cre-Lox重组系统已被用来实现小鼠体内的可控制表达。也有合成的shRNA可用，它不像病毒载体递送分子，可以通过如上所述的siRNA分子一样，能够通过化学修饰影响其活性和稳定性。公司/机构程序名称他们能提供什么Link

The Broad Institute （可通过Sigma-Aldrich和Thermo-Fisher Scientific进入）	RNAi联营（TRC）	通过公共-私人的努力，目的是创造一个经验证的shRNA文库和可用于确定人和小鼠基因功能的关联工具	链接链接到RNAi联营shRNA文库:链接
Sigma-Aldrich	功能基因组&RNAi（与TRC协同）	提供细菌甘油存储、质粒DNA和慢病毒形式的TRC shRNA	链接
Thermo-Fisher Scientific	SMARTchoice, GIPZ, TRIPZ Inducible, 和TRC慢病毒shRNA选项	提供细菌甘油存储和慢病毒形式的TRC shRNA。	链接

表三：提供预制的siRNA和shRNA的公司。对照为确保RNA干扰（RNAi）处理后观察到的效应是基因沉默的结果，而不是仅仅因为引入的siRNA/shRNA，或由于RNA干扰途径激活造成的，很重要的一点在于设置相应的对照组（表三）。两种最常见的对照是加扰对照（Scrambled Control）和非识别对照（Non-targeting Control）。加扰对照正像它听起来的那样，包含获取siRNA或shRNA序列然后随机重新排列其核苷酸序列。非识别对照，在另一方面，也是一个siRNA/shRNA序列，它被设计成不能锚定靶生物的任何已知的基因。这些对照激活了RNAi机制，使得导入的双链RNA对基因表达有基本的影响。然而，应该指出的是，即使是非识别siRNA对照也会诱导细胞内的应激反应。虽然这两种类型的对照序列都将被纳入Dicer并激活RNAi途径，但加扰对照可能会针对一个预料不到的mRNA。因此，在设计加扰对照序列的时候要特别小心，以确保遵循上述原则，且不会锚定其他的mRNA序列。对于shRNA，另一个重要的对照包括空载体对照，它不包含任何shRNA插入，却能保证转染/转导对基因表达的影响以及细胞的反应。最后，未经处理的细胞（无转染或转导）可作为参照比较其他细胞。这能允许您确定特定的siRNA转运方法的细胞毒性。公司/机构描述

Sigma-Aldrich	shRNA非识别对照
空载体对照
Thermo Scientific	shRNA阳性对照（识别eGFP）
空载体对照
Invitrogen	加扰siRNA对照
	肌动蛋白, GAPDH, 或GFP阳性对照

表四：RNAi对照。转运确切的siRNA或shRNA转运方案取决于您正在使用的细胞类型，因为不同类型的细胞核酸摄取的敏感性不同，包括您是否利用siRNA或shRNA介导的沉默，以及您正在做的实验的时间长度。转染、电穿孔、以及某些病毒转运方法是瞬时的，而慢病毒或逆转录病毒转导可将shRNA稳定整合到细胞基因组中实现持续表达。质粒DNA或双链RNA的转染或电转转染和电穿孔是其中最常见的核酸转运方式。转染涉及核酸与载体分子复合物的形成，使它们能够穿过细胞膜。 质粒编码的siRNA，有时也有shRNA，通常使用这种方法进入到细胞。商品化的转染试剂可以购买或在实验室自己制备。

脂质转染。具有长疏水链头部带正电荷基团的阳离子脂质体与带负电荷的siRNA相互作用，在脂双分子层环绕siRNA，随后被细胞内吞。

基于阳离子聚合物的纳米粒子。

这可降低毒性，提高效率，并且能够转运修饰的siRNA。

脂质或细胞穿透肽（CPP）结合。这涉及到siRNA与疏水性基团（如胆固醇）或阳离子CCP（如转运蛋白或pentatratin）的结合，能够促进向靶细胞的转运。

Biosettia专注于开发和商业化独特的技术，为生命科学研究提供更好的解决方案。该公司致力于提供创新的工具和特殊试剂，以协助全基因组功能分析和诱导多能干细胞(IPSC)的产生。

Biosettia is a San Diego-based company that provides molecular biology products and services to support researchers worldwide. Using our highly efficient lentiviral system, we have assisted many academic institutes, biotech and pharmaceutical companies in doing gene expression & inhibition-related studies.

品牌	货号	名称	规格
Biosettia	SORT-B01	pLV-H1-CMV-green	1 vial
Biosettia	SORT-B02	pLV-H1-EF1a-green	1 vial
Biosettia	SORT-B03	pLV-H1-mPGK-green	1 vial
Biosettia	SORT-B04	pLV-hU6-CMV-green	1 vial
Biosettia	SORT-B05	pLV-hU6-EF1a-green	1 vial
Biosettia	SORT-B06	pLV-hU6-mPGK-green	1 vial

表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA（siRNA或shRNA）、Dicer酶，Argonaute蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha、RISC、TRBP和PACT。术语描述

siRNA	小干扰（siRNA），有在3’端有两个碱基的游离，可激活RNA干扰，通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。
shRNA	短发夹RNA （shRNA） ，包含一个环结构，可加工成siRNA，也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解.
Drosha	是一种核糖核酸酶III的酶，可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA。
Dicer	核糖核酸酶III酶，能够将双链RNA加工成在3‘端有两个碱基游离的20-25 bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA，而Dicer-1对miRNA的加工有重要作用
RISC	最小RNA诱导沉默复合物（RISC） 包含Argonaute蛋白和相关的siRNA。也可能包含PACT、TRBP和Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到确切的描述。
TRBP	Dicer剪切双链RNA以及随后转运给RISC的过程中需要
PACT	蛋白R（PKR）-激活蛋白（PACT）。Dicer和TRBP参与双链RNA剪切相关.
Argonaute family of proteins	和单链的RNA（siRNA）共同组装形成RISC。绑定21-35个核苷酸的RNA，包括miRNA和siRNA以及相关的靶mRNA，然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切作用。剪切作用发生在反义链（引导链）RNA的第10th和第11th个核苷酸之间。

表一：RNAi机制的主要组成元件。siRNAvs.shRNA作用机制两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA（siRNA）和基于载体的短发夹RNA（shRNA）。虽然siRNA和shRNA（图1）都可用于蛋白沉默，但它们的作用机制有所不同（图2）。不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中（参见转运机制获取更多细节）。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的，但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer一起形成复合物，双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合，RISC由Argonaute-2 （Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白（TRBP）组成。然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。5\\\'端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中。[放大]图 2.RNAi介导的基因沉默机制。 在细胞核表达后，shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中，在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上，它们与siRNA的加工方式（以短的双链形态导入细胞，然后被Dicer识别）相同。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后，它们识别mRNA占有互补序列，导致其降解。源自 [3] 。shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成，形成发夹结构，茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起（图1b和1c）。通过与miRNA的加工相同的RNAi机制，shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体，shRNA被导入靶细胞的细胞核内，在某些情况下，载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前，这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除发卡结构，产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。一旦被整合到RISC后，shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分，siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA，从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点，siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物，而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA，然后由Dicer酶加工，形成正反馈循环，增加了siRNA的量。应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。该过程图2中有阐述。人们对RISC发现靶mRNA的过程还没有很好的理解。然而，Ameres等的报告显示细胞mRNA的靶序列的亲近性影响了它的剪切。他们还指出，RISC不是作用于未折叠的RNA。他们提出了一个模型，在该模型中，RISC非特异性的方式通过随机扩散与单链RNA接触，5\\\'末端碱基配对比3\\\'末端更有效率。这似乎决定了RISC与靶mRNA的稳定结合。蚂蚁淘生物致力于成为科研试剂搜索、采购一体化解决方案提供商！我们的优势：1，覆盖欧美的全球采购中心，总部设立在美国新泽西，采购团队有30多人，能进口涵盖抗体，蛋白，细胞，血清，耗材等的全门类生物产品。2，货品多且全，目前，以我们美国公司为主体，与欧美600多个品牌建立了正式的代理与合作，基本涵盖所有的生物试剂门类，特别是二三线高质量品牌产品，优势更大！