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shRNA比siRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染，克服了某些类型的细胞不能转染的难题，能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达，能够与报告基因共表达。此外，它们能减少脱靶效应（在下面进一步讨论）。

许多实验室已发表了用于转染的长双链RNA的合成方案。但是，每种方法的效力是依赖于整个系统的。此外，长双链RNA会激活先天免疫反应，导致细胞死亡。影响shRNA活性的因素，包括环结构，发夹结构热力学性质，二级结构以及周围序列。siRNA和shRNA之间进行选择时，要考虑的一个重要因素是实验时间的长短。siRNA在细胞中瞬时表达的，而shRNA可以通过病毒介导的转导保持稳定。

siRNA/shRNA设计指导在主要RNAi产品制造商那里都能获得

• 19-29个核苷酸的siRNA序列通常是最有效的。长于30个核苷酸可导致非特异性沉默。
• 识别的理想位点包括靶mRNA序列中的AA二核苷酸区和3\'端19个核苷酸的位点。通常情况下，siRNA与3’端为dUdU或者dTdT的游离碱基的mRNA结合效率更高。较新的数据表明，其他种类的二核苷酸也可保持活性，但siRNA能够被核糖核酸酶在单链的G残基处裂解，因此应避免GG结构。
• 由于mRNA往往高度折叠并于调控蛋白结合的，应该要在不同位点选择至少2-4个靶序列。避免设计含有4-6个poly（T）的序列，因为它会作为RNA合成酶III的终止信号。
• 检查以确保您的siRNA序列与其他编码序列没有同源性。
• 序列中的G/C含量应该在35-55％之间。

shRNA应包含正义和反义序列（每个为19-21个核苷酸的长度）由环结构分隔，以及5\'端AAAA的游离片段。设计环结构时，Ambion的科学家和其他人建议使用9nt的空白间隔（TTCAAGAGA），而Invivogen在某些载体中采用了长度为7nt的环（TCAAGAG），这可根据您的系统变化。3〜9个核苷酸长度的环序列被证明是有效的。此外，当创建shRNA盒时，正义链首先合成，然后是间隔序列，最后是反义链。shRNA结构中5\'端游离应避免，因为它们可能会导致shRNA的沉默。除了手动设计siRNA或shRNA，也有一些设计程序可供使用。他们中有几个包含在表二中了。此外，多个公司提供预制的siRNA和shRNA序列（代表性例子见表三）。

多数shRNA通过载体转录而来。表达最常见的是由聚合酶IIIU6启动子驱动，它驱动高水平的组成型表达，或由较弱的H1启动子驱动。与siRNA系统相比，shRNA的一个主要优点是，shRNA可设计为诱导性的。有商品化的四环素-开和四环素-关诱导系统，以及结构含有改良的U6启动子由昆虫蜕皮类固醇性激素蜕皮激素诱导。一个Cre-Lox重组系统已被用来实现小鼠体内的可控制表达。也有合成的shRNA可用，它不像病毒载体递送分子，可以通过如上所述的siRNA分子一样，能够通过化学修饰影响其活性和稳定性。

为确保RNA干扰（RNAi）处理后观察到的效应是基因沉默的结果，而不是仅仅因为引入的siRNA/shRNA，或由于RNA干扰途径激活造成的，很重要的一点在于设置相应的对照组（表三）。两种最常见的对照是加扰对照（ScrambledControl）和非识别对照（Non-targetingControl）。加扰对照正像它听起来的那样，包含获取siRNA或shRNA序列然后随机重新排列其核苷酸序列。非识别对照，在另一方面，也是一个siRNA/shRNA序列，它被设计成不能锚定靶生物的任何已知的基因。这些对照激活了RNAi机制，使得导入的双链RNA对基因表达有基本的影响。然而，应该指出的是，即使是非识别siRNA对照也会诱导细胞内的应激反应。虽然这两种类型的对照序列都将被纳入Dicer并激活RNAi途径，但加扰对照可能会针对一个预料不到的mRNA。因此，在设计加扰对照序列的时候要特别小心，以确保遵循上述原则，且不会锚定其他的mRNA序列。

对于shRNA，另一个重要的对照包括空载体对照，它不包含任何shRNA插入，却能保证转染/转导对基因表达的影响以及细胞的反应。最后，未经处理的细胞（无转染或转导）可作为参照比较其他细胞。这能允许您确定特定的siRNA转运方法的细胞毒性。

确切的siRNA或shRNA转运方案取决于您正在使用的细胞类型，因为不同类型的细胞核酸摄取的敏感性不同，包括您是否利用siRNA或shRNA介导的沉默，以及您正在做的实验的时间长度。转染、电穿孔、以及某些病毒转运方法是瞬时的，而慢病毒或逆转录病毒转导可将shRNA稳定整合到细胞基因组中实现持续表达。

转染和电穿孔是其中最常见的核酸转运方式。转染涉及核酸与载体分子复合物的形成，使它们能够穿过细胞膜。质粒编码的siRNA，有时也有shRNA，通常使用这种方法进入到细胞。商品化的转染试剂可以购买或在实验室自己制备。

• 脂质转染。具有长疏水链头部带正电荷基团的阳离子脂质体与带负电荷的siRNA相互作用，在脂双分子层环绕siRNA，随后被细胞内吞。
• 基于阳离子聚合物的纳米粒子。
• 这可降低毒性，提高效率，并且能够转运修饰的siRNA。
• 脂质或细胞穿透肽（CPP）结合。这涉及到siRNA与疏水性基团（如胆固醇）或阳离子CCP（如转运蛋白或pentatratin）的结合，能够促进向靶细胞的转运。

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特殊类别

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（此处以Amsbio为例，实际不同品牌不同产品类型所涉及流程稍有不同）

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苏州蚂蚁淘生物科技有限公司简介

依托于集团公司深厚的资源和超过400家国内优质客户群体，生命科学领域一站式供应链体系，以及高风险生物材料进出口平台的优势，蚂蚁淘生物严格筛选国际创新且经过同行验证过的产品和技术，引入中国市场，开发、孵育和推广。

自公司成立以来，与海外一线品牌建立了长期的交流与合作关系，其中包括多家国际著名细胞和菌种保藏中心。仅2019年内，蚂蚁淘生物接受国内制药企业、科研机构、检测机构和大专院校等单位的委托，从近150个品牌引进各类生物试剂，其中不乏包括细胞株，慢病毒，人体组织切片，血液制品等特种试剂。公司与北京中关村联合创新（绿通北平台）建立了长期的交流与合作关系，可为国内客户提供进口代理业务，完成一站式前置审批、风险评估、检疫审批、清关查验、物流仓储等工作。

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